大肠杆菌和丁酸梭菌通过调控线粒体功能影响IPEC-J2细胞代谢与凋亡的机制研究（一）
2.3 不同浓度大肠杆菌及丁酸梭菌对IPEC-J2细胞形态结构的影响
为了了解不同浓度微生物对IPEC-J2细胞形态结构的影响，IPEC-J2细胞培养后分别加入不同浓度的大肠杆菌和丁酸梭菌处理，用改良的吉姆萨染色后对细胞形态结构进行观察，与对照组相比，随着处理时间增长，大肠杆菌处理组严重损伤IPEC-J2细胞，细胞破裂，细胞形态结构受到破坏，并且随着大肠杆菌的浓度增加，IPEC-J2细胞形态受损情况也随之加重（图3A）；而丁酸梭菌处理组对IPEC-J2细胞结构无影响，随着处理时间和处理浓度增加，IPEC-J2细胞结构保持完整、细胞形态规则，与对照组无明显差异（图3B）。结合大肠杆菌和丁酸梭菌对IPEC-J2细胞活性（图2）和形态结构的影响，采用106 CFU·mL-1丁酸梭菌、108 CFU·mL-1大肠杆菌进行后续试验，处理时间为1 h。
A.大肠杆菌定植下IPEC-J2细胞的生长情况；B.丁酸梭菌定植下IPEC-J2细胞的生长情况
图3 不同浓度微生物对IPEC-J2细胞形态结构的影响（400×）
2.4 微生物及代谢物对IPEC-J2细胞ATP含量和ROS的影响
图4显示了用ROS和ATP试剂盒与酶标仪测定微生物及代谢物对IPEC-J2细胞ATP含量和ROS的影响。与对照组相比，丙酸和大肠杆菌处理组显著提高了ROS含量（P<0.05）；而丁酸梭菌和LPS处理组ROS含量显著降低（P<0.05）；乙酸和丁酸对ROS含量无显著影响（图4A）。ATP含量检测结果显示（图4B），与对照组相比，乙酸、丙酸、丁酸和LPS处理组均显著提高了ATP含量（P<0.05）；而大肠杆菌和丁酸梭菌处理组均显著降低了ATP含量（P<0.05）。
A.IPEC-J2细胞活性氧水平的测定；B.IPEC-J2细胞ATP浓度的测定
图4 微生物及代谢物对IPEC-J2细胞中ATP含量和ROS水平的影响
2.5 微生物及代谢物对IPEC-J2细胞线粒体膜电位的影响
由图5可知，与对照组相比，大肠杆菌和LPS处理组的线粒体膜电位降低，丁酸梭菌处理组的线粒体膜电位有略微的降低；乙酸和丙酸处理组线粒体膜电位与对照组无明显差异，而丁酸处理组增加了线粒体膜电位，以上表明了致病菌或病原相关分子模式通过损伤线粒体功能，导致细胞走向凋亡反应，而有益菌及短链脂肪酸则维持了线粒体功能（图5）。
绿色荧光表示线粒体低电位，红色荧光表示线粒体高电位
图5 微生物及代谢物对IPEC-J2细胞线粒体膜电位的影响（400×）
2.6 微生物及代谢物对IPEC-J2细胞抗氧化的影响
由图6可知，与对照组相比，丙酸、丁酸、LPS和大肠杆菌的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力均显著低于对照组（P<0.05），乙酸和丁酸梭菌的SOD显著高于对照组（P<0.05）。此外，大肠杆菌和LPS的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量显著高于对照组（P<0.05），丁酸梭菌的MDA含量显著低于对照组（P<0.05），乙酸、丙酸和丁酸的MDA含量无显著影响。以上结果表明，大肠杆菌和LPS促进了脂质氧化过程，并抑制细胞的抗氧化系统；丁酸梭菌抑制了脂质氧化过程，激活了抗氧化系统。
A. IPEC-J2细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性测定；B. IPEC-J2细胞丙二醛（MDA）含量测定
图6 微生物和代谢物对IPEC-J2细胞抗氧化性能的影响
2.7 微生物及代谢物对线粒体介导的IPEC-J2细胞脂质代谢、氧化应激及细胞凋亡相关基因表达的影响
为了进一步探究大肠杆菌、丁酸梭菌、SCFAs和LPS对IPEC-J2细胞线粒体功能相关的基因及通路的调控，通过对线粒体介导的脂质代谢、氧化应激和细胞凋亡的关键基因进行定量分析，结果显示（图7），与对照组相比，丁酸梭菌处理组显著均上调ACC1、NRF1、TFAM、HO-1、APAF-1、PIG3、p53的表达（P<0.05），但对CtyC的表达量无显著性影响；大肠杆菌处理组下调了TFAM和CtyC的表达（P<0.05），上调了p53的表达（P<0.05），其余无显著性影响；丁酸下调了NRF1、TFAM、APAF-1和CtyC的表达（P<0.05），上调了p53的表达（P<0.05）。上述结果表明，丁酸抑制了线粒体介导的细胞凋亡，而丁酸梭菌激活了IPEC-J2细胞抗氧化系统和细胞凋亡系统；大肠杆菌处理使IPEC-J2细胞抗氧化系统下调。
A. 脂质代谢相关基因；B-D. 氧化应激相关基因；E. 细胞凋亡相关基因；F-H. 氧化应激、细胞凋亡相关基因
图7 微生物及代谢物对线粒体功能相关基因表达的影响