基于生长曲线的大肠杆菌与丁酸梭菌对IPEC-J2细胞线粒体功能影响研究（三）
1.2.6 具体检测方法
CCK-8：PBS处理后，每孔加入90 μL DMEM+10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。
细胞形态结构：PBS清洗后用70%乙醇固定细胞10 min，吸去乙醇，加入0.5 mL改良吉姆萨染色液（1×），染色1 h，然后用纯水清洗细胞3~4次，在倒置显微镜下观察细胞形态结构。
ATP含量测定：按照ATP剂盒说明书进行操作，操作结束后，使用酶标仪的化学发光测定RLU值，并用Nano Drop测定裂解细胞上清液测定蛋白浓度。
线粒体膜电位：按照线粒体膜电位试剂盒说明书进行JC-1探针装载，操作结束后，在荧光显微镜下观察。
ROS测定：PBS清洗后，收集细胞，使用荧光酶标仪在激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，测定荧光强度。
SOD活性测定：PBS清洗后，吸取200 μL Western及IP细胞裂解液，裂解细胞，然后按照总SOD活性试剂盒说明书进行操作，操作结束后，在450 nm处测定吸光度，并用Nano Drop测定裂解细胞上清液中蛋白浓度。
MDA含量测定：PBS清洗后，吸取200 μL Western及IP细胞裂解液，裂解细胞，然后按照MDA检测试剂盒说明书进行操作，操作结束后，随后用酶标仪在532 nm测定吸光度，并用Nano Drop测定裂解细胞上清液的蛋白浓度。
相关基因表达检测：PBS清洗一次后，使用总RNA提取试剂盒提取RNA，使用Prime Script? RT reagent Kit with gDNA试剂盒进行反转录，进行实时定量检测。
1.3 数据统计
试验数据采用SPSS 18.0进行整理和分析，使用GraphPad Prism 8.0.2进行图片绘制和t检验处理，试验结果以“平均值±标准差”表示，统计学显著性定义为*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001。
2 结果
2.1 大肠杆菌和丁酸梭菌的生长曲线
结果（图1A）大肠杆菌在1.5 h处开始进入对数生长期，在6 h处进入平台期；丁酸梭菌在2 h处开始进入对数生长期，在6 h处开始进入平台期，在22 h处开始进入衰亡期（图1B）。因细菌在对数生长期生长情况和活性最好，所以本次试验丁酸梭菌和大肠杆菌使用培养至3 h处的菌悬液进行后续试验。
图1 大肠杆菌和丁酸梭菌的生长曲线图
2.2 微生物及代谢物对IPEC-J2细胞活性的影响
使用CCK-8试剂盒评估不同浓度菌对IPEC-J2细胞的影响，得到的结果（图2）显示，与对照组相比，处理1~6 h，107 CFU·mL-1大肠杆菌和108 CFU·mL-1大肠杆菌极显著降低IPEC-J2细胞活性（P<0.01，图2B）；与对照组相比，在0~48 h，108 CFU·mL-1丁酸梭菌处理组均显著增加IPEC-J2细胞活性（P<0.05），其余丁酸梭菌处理组与对照组无显著性差异；且在1~48 h细胞活性呈现下降的趋势（图2A）；在1~12 h，乙酸、丙酸、丁酸和LPS处理组与对照组细胞活性无显著性差异，但在24 h和48 h，乙酸组显著增加细胞活性，其余时间无显著性影响（图2C）。
A.IPEC-J2细胞在丁酸梭菌定植下的OD450 nm测定值；B.IPEC-J2细胞在大肠杆菌定植下OD450 nm的测定值；C.IPEC-J2细胞在细菌代谢物中OD450 nm的测定值。*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001，下同
图2 微生物及代谢物对IPEC-J2细胞活性的影响
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