AEG-1促进肝癌生长与定向肺转移的作用与机制研究（二）
1.2.3建立肝癌血行播散模型
按照1.2.1方法准备各组肝癌细胞,用手捏住裸鼠尾巴选择两侧静脉血管用胰岛素注射器吸取细胞悬液100μL缓慢注射，拔出针后用棉签按住注射部位以免细胞悬液流出。
1.2.4动物活体成像
荧光素钾/镁盐(激活荧光素酶的底物)的配制:室温溶解荧光素于DPBS(不含镁离子和钙离子)中使终浓度为15mg/mL;在超净台内，先将0.22μm滤膜过滤器用5~10mL无菌水过滤并将水丢弃;然后过滤灭菌溶解充分的荧光素溶液，并用1.5mLEP管分装，避光冻存一20℃备用。
从动物房取出实验动物，尽量保证其处于无菌环境。成像前将超净台及房间进行紫外照射30 min;1%戊巴比妥钠溶液麻醉实验动物,待动物麻醉后再行腹腔注射荧光素;每个小鼠注射10μL/g荧光素储存液,5~10min后用活体成像系统进行成像。
1.2.5裸鼠的处死与苏木精-伊红(HE)染色
术后继续饲养,观察裸鼠的生长情况,如体重增减,活动程度的变化以及对外界刺激的反应情况等,观察裸鼠生长35d后处死动物,无菌条件下,对鼠进行系统解剖,并观察肝癌在肝内和肺部的转移情况,同时收集裸鼠全部肺组织、肝脏组织,进行固定、切片、免疫组化染色观察组织成瘤情况，记录肿瘤大小、称取瘤重。组织包埋及HE染色由武汉百奥斯生物科技有限公司制作。
1.3实时定量PCR检测
运用Trizol(Invitrogen公司)法提取细胞的总RNA,反转录合成cDNA。采用一步法试剂盒进行荧光定量PCR，检测AEG-1和β-actin的相对表达量，引物序列分别为:AEG-1，正向:5'-TGTT-GAAGTGGCTGAGGG-3’，反向:5'-CAGGAAAT-GATGCGGTTG-3';β-actin,正向:5'-GTTGCGT-TACACCCTTTCTTG-3',反向:5'-GACTGCTGT-CACCTTCACCGT-3'。
1.4 Western blot检测
配制胞核蛋白裂解液，bufferA:10mmol/L HEPES-KOH(pH=7.9),1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl,0.5 mmol/L DTT,0.2 mmol/L PMSF,1μg/mL亮肽素;buffer B:20 mmol/L HEPES-KOH(pH7.9)，25%甘油，1.5 mmol/L MgCl2,420 mmol/L NaCl,0.2 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L DTT,0.2 mmol/L PMSF,1μg/mL亮肽素(Ferments公司)。用核蛋白裂解液抽提转染细胞的总蛋白，测定蛋白提取液浓度，-70℃保存备用。取总蛋白50μg与上样缓冲液充分混匀，100℃水浴10min变性后上样。12% SDS-PACE凝胶行电泳分离后，转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1h，加兔抗人AEG-1一抗(Abcam公司，1:1000)4℃孵育过夜，TBST液漂洗，加Cy3标记的羊抗兔IgG二抗(武汉博士德公司，1:4000)室温孵育30min,TBST液漂洗。ECL试剂(Pierce公司)显色，曝光，显影，定影，用X线胶片拍照保存。
ImageJ图像分析软件测定条带的灰度值，以与内参β-actin蛋白灰度值的比值表示蛋白质的相对表达量。
1.5统计学方法
应用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1实时定量PCR及Western blot检测SMMC-7721肝癌细胞株AEG-1 mRNA及蛋白表达
应用实时定量PCR检测SMMC-7721肝癌细胞株AEG-1 mRNA表达情况，结果显示:SMMC-7721-AEG-1-L、SMMC-7721-control-L肝癌细胞株AEG-1 mRNA表达量分别为[(4.58±0.32)vs.(0.86±0.05),P<0.05];SMMC-7721-shAEG-1-P、SMMC-7721-control-P肝癌细胞株 AEG-1 mR-NA表达量分别为[(0.80±0.07)vs.(2.61±0.13),P<0.05]。不同组别肝癌细胞AEG-1 mR-NA表达情况见图1A。
应用Western blot检测SMMC-7721肝癌细胞株AEG-1蛋白表达情况，结果显示:SMMC-7721-AEG-1-L、SMMC-7721-control-L肝癌细胞株AEG-1蛋白表达量分别为[(0.517±0.009)vs.(0.232±0.004),P<0.05];SMMC-7721-shAEG-1-P、SMMC-7721-control-P肝癌细胞株AEG-1蛋白表达量分别为[(0.272±0.007)vs.(0.582±0.004),P<0.05]。不同组别肝癌细胞AEG-1蛋白表达情况，见图1B、1C。
图1实时荧光定量PCR及Western blot检测SMMC-7721细胞株转染情况