驴乳腺上皮细胞分离、培养及生长曲线绘制（三）
2结果与分析
2.1驴乳腺上皮细胞的形态学特征
在原代细胞培养过程中,接种41 h后可见部分细胞贴壁并呈放射状生长,形成孤立的岛屿状细胞集落,此时细胞形态不规则(图1-a);接种64 h后细胞集落逐渐扩大并相互融合,形态转变为典型的上皮样多角形,呈现铺路石样排列(图1-b);接种85 h后细胞铺满培养瓶底,形成单层、紧密镶嵌的铺路石样结构,细胞形态饱满(图1-c)。当细胞汇合度达80%时进行传代,未纯化的F1代驴乳腺上皮细胞中可见成纤维细胞混杂生长(图1-d),通过简单纯化处理后,可获得纯度较高的细胞,细胞形态以多角形或卵圆形为主,少数呈短梭形,细胞间连接紧密且边界清晰,胞质较为丰富(图1-e)。细胞冻存60 d后复苏,其形态与冻存前无明显区别(图1-f)。
图1驴乳腺上皮细胞的形态学特征a:接种41 h后的岛屿状细胞集落;b:接种64 h后细胞集落扩大、融合;c:接种85 h后细胞逐渐铺满培养瓶;d:未纯化的F1代驴乳腺上皮细胞中混杂着成纤维细胞;e:纯化后的驴乳腺上皮细胞以多角形为主,偶见短梭形;f:冻存后复苏的驴乳腺上皮细胞。
2.2驴乳腺上皮细胞的生长曲线
如图2所示,驴乳腺上皮细胞的生长曲线呈现典型“S”型。在0~18 h的初始培养阶段,细胞处于生长迟滞期,增殖速率较低;随后进入18~42 h的指数生长期,细胞分裂明显加快;培养至42~60 h后达到生长平台期,增殖速率逐渐下降。这些结果表明在本试验培养条件下获得的驴乳腺上皮细胞具有理想的生长特性。
图2驴乳腺上皮细胞的生长曲线
2.3驴乳腺上皮细胞中特异性基因表达
如图3所示,特异性基因CK18在体外分离培养的细胞中特异性表达,表明其为驴乳腺上皮细胞。
图3驴乳腺上皮细胞的琼脂糖凝胶电泳M:DL500 DNA Marker;1:磷酸甘油醛脱氢酶;2:细胞角蛋白18。
2.4驴乳腺上皮细胞的免疫荧光染色
如图4所示,通过免疫荧光技术分析发现,CK18在驴乳腺上皮细胞中呈现典型的阳性表达(绿色),与DAPI染色的细胞核(蓝色)共定位。免疫荧光检测结果显示,驴乳腺上皮细胞纯度超90%。
图4驴乳腺上皮细胞的免疫荧光染色
3讨论
驴乳腺上皮细胞的体外分离与培养是解析驴的泌乳调控机制、乳腺生理功能及乳成分生物合成途径的关键技术基础。在现有的乳腺上皮细胞分离技术中,组织块法与酶消化法各具优势,其中酶消化法因技术成熟、操作便捷而最为常用。该方法的原理是通过特定消化酶(如胶原酶、胰蛋白酶等)单用或联用对剪碎的乳腺组织进行温和解离,可高效分离出活性高、分散性良好的目标细胞。尽管酶消化法在细胞获取效率上具有显著优势,但其核心环节消化酶种类筛选、酶作用浓度优化及消化时长控制需精准调控。若酶活性过高或消化时间超限,易导致细胞膜完整性受损,显著降低细胞的存活率与功能状态。多位学者采用不同的酶消化方案均成功分离出了高活性的乳腺上皮细胞,例如,李晓斌等利用0.1%胶原酶Ⅰ联合0.01%透明质酸酶对马乳腺组织进行5 h的消化;孙培皓等利用0.05%胶原酶Ⅰ与0.05%透明质等配比混合对奶牛乳腺组织进行7~9 h的消化;郝颖等利用0.5%胶原酶Ⅱ对奶牛乳腺组织进行1 h的消化。本研究基于驴乳腺组织特异性(如基质致密性、细胞黏附因子表达差异),在参考上述方法的基础上进行优化:选用1 mg/mL的胶原酶Ⅳ(其酶切位点更温和,可减少细胞膜损伤风险)替代传统胶原酶Ⅰ/Ⅱ对驴乳腺组织进行消化,消化时间为1 h,成功分离出驴乳腺上皮细胞。
本研究在细胞汇合度达到80%时,采用胰蛋白酶消化法进行细胞传代。参照曹家铭等的差时消化法,利用成纤维细胞(1~2 min)和乳腺上皮细胞(5 min)对胰蛋白酶敏感性差异进行细胞分离,成功获得较高纯度的驴乳腺上皮细胞,该细胞12 h内贴壁率超过85%,18 h进入对数生长期。本研究发现,分离的驴乳腺上皮细胞的原代细胞在培养初期增殖速率通常较为缓慢,2~4 d可达到融合状态并适宜传代;传代后的细胞进入对数生长期,增殖速率显著提升,其增殖过程符合典型的细胞生长曲线特征,约48 h即可达到80%~90%的汇合度。
乳腺上皮细胞的鉴定主要涉及两大方面:一是通过形态学特征和生长特性(如生长曲线)进行初步判断;二是借助分子生物学手段(如基因检测和免疫荧光标记)进行特异性验证。乳腺上皮细胞通常呈现多角形形态,常以岛屿状或铺路石状排列。在本研究建立的培养体系中,分离获得的驴乳腺上皮细胞表现出典型的乳腺上皮细胞形态学特征,并呈现集落样生长模式;生长动力学分析显示,细胞增殖呈现典型的“S”型曲线,表明其保持了正常的细胞周期特征。这一生长特性与在奶牛乳腺上皮细胞和绵羊乳腺上皮细胞上的报道一致。形态学观察是鉴定乳腺上皮细胞的常用方法之一,但单纯依靠该方法评估细胞可靠性存在一定局限性,且无法检测细胞纯度,因此本研究对分离培养的驴乳腺上皮细胞进一步开展分子生物学验证。作为上皮细胞鉴定的重要分子标志物,中间纤维蛋白CK18在细胞骨架形成中发挥关键作用,已被广泛应用于多种哺乳动物乳腺上皮细胞的鉴定研究。本研究通过琼脂糖凝胶电泳证实,分离培养的驴乳腺上皮细胞中可稳定表达上皮细胞特征性基因CK18。免疫荧光染色结果进一步显示,CK18蛋白在分离培养的驴乳腺上皮细胞中呈现阳性定位特征。综合上述鉴定结果,本研究成功建立了高纯度的驴乳腺上皮细胞分离培养方法,可为后续开展相关试验提供可靠的细胞来源。
4结论
本研究采用酶消化法有效实现了驴乳腺上皮细胞的体外分离和培养。通过多角度包括细胞形态观察、生长动力学分析、特异性基因检测及免疫荧光染色等验证,证实了所获细胞的可靠性,可为后续驴乳成分调控机制探索和乳腺炎模型建立提供重要的细胞材料。
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