驴乳腺上皮细胞分离、培养及生长曲线绘制（二）
1.2试验方法
1.2.1驴乳腺上皮细胞的原代培养
在无菌条件下去除驴乳腺组织外的筋膜、脂肪及纤维结缔组织,将处理后的组织块放入3×双抗DPBS中;在超净台进行3步清洗(先用3×双抗DPBS漂洗3次,再以75%乙醇浸泡30 s进行表面消毒,最后用1×双抗DPBS漂洗3次);用无菌剪取组织样本中腺泡丰富的部位并转移至5 mL无酶管,机械剪碎至糊状;加入等体积的胶原酶Ⅳ(1 mg/mL)后,37℃消化1 h(间隔15 min混匀1次);经80目尼龙滤网过滤后,滤液以222×g离心3 min收集沉淀;所得沉淀经DPBS重悬清洗2次后离心;用完全培养基重悬细胞,接种至透气T25细胞培养瓶,于37℃、5%CO2培养箱培养,每48 h更换1次培养基,待贴壁细胞汇合度达80%~90%时,进行传代与纯化操作。
1.2.2驴乳腺上皮细胞的传代和纯化
乳腺上皮细胞原代培养过程中常伴随成纤维细胞污染,基于两者对胰蛋白酶耐受性差异进行选择性分离。当培养的驴乳腺上皮细胞汇合度达到80%~90%时传代。首先移除原培养基,随后用DPBS轻缓冲洗细胞2~3次;向培养瓶内加入1 mL预温至37℃的0.25%的胰蛋白酶溶液,将培养瓶移至37℃培养箱中进行消化处理,消化时间控制在30~60 s;细胞消化过程需在显微镜下实时监控,鉴于成纤维细胞对胰蛋白酶更为敏感,当其形态开始变圆并部分脱离瓶壁时(此时驴乳腺上皮细胞仍保持贴壁状态),加入2 mL完全培养基终止消化;弃消化液,用DPBS漂洗细胞2次;用1 mL 0.25%胰蛋白酶进行二次消化,消化时间控制在5 min左右;待80%细胞脱落后加入2 mL完全培养基终止消化;采用移液器轻柔吹打细胞团块直至形成单细胞悬液,转移至新的15 mL离心管进行离心处理;222×g离心3 min后弃上清,所得细胞沉淀经DPBS清洗1次后离心;用完全培养基重悬细胞,计数后以1.5×105个/mL的密度接种至新的透气T25细胞培养瓶,于37℃、5%CO2培养箱培养。如此连续纯化2~3次,可有效清除90%以上的成纤维细胞,最终实现驴乳腺上皮细胞纯度>95%。
1.2.3驴乳腺上皮细胞的冻存和复苏
传代1~2次后对细胞进行冻存。当细胞汇合度达到80%~90%时,首先弃去原培养基,采用37℃预温的DPBS清洗,随后加入1 mL的0.25%胰蛋白酶消化液,置于CO2培养箱中37℃孵育;通过倒置显微镜动态观察,当细胞间隙显著增大且边缘回缩时,立即按1∶1体积比加入完全培养基终止酶解反应;采用无菌移液器沿培养面多角度轻柔吹打,获得单细胞悬液后转移至15 mL离心管,222×g离心3 min;弃上清,用1 mL细胞冻存液重悬后转移到2 mL冻存管中,使用程序降温盒逐步降温后转入液氮长期保存。
细胞复苏前,需将恒温水浴锅的温度调节至37℃并保持稳定状态;将装有驴乳腺上皮细胞的冻存管从液氮中迅速取出后,立即置于37℃水浴锅中轻柔振荡,直至细胞冻存液完全溶解(一般耗时1~2 min);使用移液器将细胞悬液移至15 mL离心管内,沿管壁缓缓加入3 mL完全培养基,轻柔吹打使细胞分散,随后将离心管置于离心机,以222×g离心3min;弃上清,用完全培养基重悬,接种至透气T25细胞培养瓶,于37℃、5%CO2培养箱培养。
1.2.4驴乳腺上皮细胞生长曲线的绘制
将驴乳腺上皮细胞悬液(4×104个/mL)按1 mL/孔接种至10块24孔板;37℃、5%CO2培养箱恒温培养60 h;每隔6 h取出1块24孔板,每孔加100μL CCK-8试剂,37℃孵育3 h后,采用酶标仪测定450 nm处吸光度(OD450 nm)值,并根据OD450 nm值绘制生长曲线。
1.2.5驴乳腺上皮细胞中特异性基因的检测
驴乳腺上皮细胞总RNA的提取采用TRIzol法,经质检合格后反转录获得cDNA,随后进行PCR,分析目标基因的表达水平。选用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因,其引物通过Primer Premier 5.0软件设计,目的基因CK18的引物参照李晓斌等的报道,引物序列见表1。PCR扩增完成后,取5μL扩增产物与1μL的6×Loading buffer混合,在2%琼脂糖凝胶中进行电泳,最后使用凝胶成像系统观察条带大小及特异性。
表1引物序列
1.2.6驴乳腺上皮细胞的免疫荧光鉴定
将处于对数生长期的细胞按照4×104个/mL的密度接种到已预先放置细胞爬片的24孔板中。待细胞汇合度达60%~70%时,吸除培养基,PBS漂洗1遍,在4%多聚甲醛(4℃)中固定30 min;PBS漂洗3次(5 min/次);取出爬片,吸净边缘水分,置于培养皿支架上,在防水膜上滴加50μL封闭液(配方:0.5%Trition X-100与PBS等体积混合,添加10%山羊血清),将爬片细胞面朝下覆盖封闭液,室温孵育2 h;弃封闭液,滴加50μL一抗工作液(一抗∶PBS=1∶100),将爬片转移至湿盒中,4℃条件下孵育12~16 h;次日复温后,避光滴加二抗工作液(二抗∶PBS=1∶500),室温孵育2 h;PBS漂洗3次(5 min/次),DAPI染核5 min,再用PBS漂洗3次(5 min/次);完成封片处理后,通过荧光显微成像系统获取图像和数据。
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