驴乳腺上皮细胞分离、培养及生长曲线绘制（一）
摘要
本研究旨在建立驴乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定方法,为驴乳腺相关研究提供细胞模型。利用胶原酶Ⅳ从驴乳腺组织分离获得原代细胞,通过差速消化法纯化细胞,并通过形态学观察、特异性基因检测以及免疫荧光标记对纯化的细胞进行鉴定。结果显示:利用酶消化法分离培养的驴乳腺上皮细胞呈现多角形或卵圆形形态,且呈铺路石样排列。纯化后的驴乳腺上皮细胞具有典型的“S”型生长曲线。琼脂糖凝胶电泳显示,培养的驴乳腺上皮细胞可表达特异性基因细胞角蛋白18(CK18)。免疫荧光结果显示,CK18在驴乳腺上皮细胞中呈现阳性表达。本研究成功建立了驴乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定体系,可为深入研究驴乳腺的生理功能以及泌乳机制提供重要细胞材料。
驴奶作为一种高营养价值乳品,因富含乳清蛋白、多不饱和脂肪酸及溶菌酶等活性成分,越来越受到消费者的青睐。乳腺是哺乳动物特有的泌乳器官,其功能核心在于乳腺上皮细胞。作为乳腺组织中实现泌乳功能的核心功能单元,乳腺上皮细胞不仅主导乳源性蛋白、乳脂类物质及乳糖的生物代谢过程,同时在腺体发育动态调控及免疫稳态维持等方面也具有重要调控功能。近年来,乳腺上皮细胞的体外分离培养已成为研究哺乳动物泌乳机制、乳腺疾病模型构建及功能性乳制品开发的重要基础。
目前,针对奶牛、小鼠等模式动物的乳腺上皮细胞研究已较为成熟,然而对于驴这一特色畜种的乳腺上皮细胞研究仍处于起步阶段,其分离培养体系的建立与鉴定亟待探索。驴乳的独特成分与其乳腺上皮细胞代谢特性密切相关,但因缺乏稳定的体外培养模型,相关分子机制研究受限。相较于反刍动物,驴的乳腺组织结构、泌乳周期与泌乳特点等存在显著差异,这不仅增加了乳腺上皮细胞体外培养的难度,而且其增殖调控机制尚未明确,需要系统优化培养基成分及培养条件。因此,本试验拟建立驴乳腺上皮细胞的高效分离与培养体系,以期为解析驴的泌乳机制、探究乳腺炎致病机理及调控乳功能性成分合成奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1驴乳腺组织采集
本试验已获得内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会的许可(批准号:NND2021050)。选用内蒙古呼和浩特市内蒙古草原御驴科技牧业有限公司养殖基地的5岁泌乳中期成年母驴,无菌采集乳腺组织样本,将乳腺组织上的血液和乳汁用生理盐水清洗干净,再放入含有青-链霉素(双抗)的生理盐水(每500 mL含3 mL双抗)中,置于4℃冰袋保温的泡沫箱中迅速带回实验室进行后续处理。
1.1.2主要试剂
胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)溶液、0.25%胰蛋白酶消化液、双抗、磷酸盐缓冲溶液(PBS)和杜氏磷酸盐缓冲溶液(DPBS)购自美国Gibco公司;胶原酶Ⅳ、两性霉素B、表皮生长因子(EGF)、氢化可的松、二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖购自美国Sigma公司;胎牛血清(FBS)购自上海逍鹏公司;Hifair®Ⅱ第1链cDNA合成预混试剂、Hieff®SYBR Green实时荧光定量预混试剂购自上海翌圣生物公司;CCK-8购自上海碧云天生物技术有限公司;6×Loading buffer、DL500 DNA Marker、RNAiso Plus购自宝日医生物技术(北京)有限公司;DMEM基础培养基购自百迪生物科技公司;兔抗细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体购自美国Proteintech公司;山羊血清、4%多聚甲醛、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和Triton-X 100购自中国北京索莱宝科技有限公司。
1.1.3主要仪器
生物安全柜(ACB-6A,ESCO,新加坡)、CO2培养箱(Forma-311,Thermo,美国)、离心机(2-16PK,Sigma,美国)、高压灭菌锅(SX-500,TOMY,日本)、凝胶成像系统(Tanon Gis-1000,上海)、倒置显微镜(Leica,德国)、移液枪(Eppendorf,德国)、迷你离心机(D1008,SCILOGEX,美国)、全自动酶标仪(Spark,TECEN,瑞士)、荧光定量PCR仪(LightCycler 480Ⅱ,Roche,美国)、凝胶电泳仪(Bio-Rad,美国)、超低温冰箱(Forma-8600,Thermo,美国)、荧光倒置显微镜(DS-Ri2,Nikon,日本)。
1.1.4溶液的配制
完全培养基:取100 mL DMEM基础培养基,依次加入10 mL FBS、2 mL双抗、0.5 mL ITS溶液,随后加入EGF(终浓度10 ng/mL)、两性霉素B(终浓度2.5μg/mL)和氢化可的松(终浓度1μg/mL),充分混匀后4℃保存。
3×双抗DPBS:每500 mL DPBS中含3 mL双抗。
1×双抗DPBS:每500 mL DPBS中含1 mL双抗。
细胞冻存液:5%DMSO+45%DMEM基础培养基+50%FBS,现用现配。