人类微生物组遗传与地理信息和物种水平传播能力相关性研究（三）
系统发育关联分析证实了三种早期存在的长双歧杆菌亚种
在人体测量指标的关联中，年龄是与SGB种内多样性关联最普遍的表型（253/583个SGB），其次是BMI（12/583）和性别（6/583）。对于14个SGB，年龄关联由婴儿特异性进化枝的存在驱动。我们在欧洲样本中发现13例具有婴幼儿（定义为≤2岁个体）系统发育信号的物种，在非洲样本中发现2例。最强的关联涉及长双歧杆菌，这是唯一在欧洲（elpd_diff = -288）和非洲（elpd_diff = -9.1）人群中均显示婴儿特异性进化枝的物种。事实上，对长双歧杆菌系统发育的分析显示，这与婴幼儿和年长个体之间明确的进化枝分离相关（图3A和3B）。
图3 | 长双歧杆菌亚种与年龄和大陆相关
（A）欧洲和非洲部分样本中SGB17248长双歧杆菌的系统发育树显示，一个进化枝以2岁以下个体为主（红色末端），另一个进化枝以2岁以上个体为主（灰色末端）。外环标注了anpan模型给出的关联系统发育信号（系统发育效应中位数，见STAR方法）、年龄类别和大陆信息。
（B）婴儿主导的进化枝几乎完全由2岁以下个体的样本组成，而成人主导的进化枝包含2岁以上和以下个体的样本。
（C）（A）中系统发育树的子集。婴儿主导的进化枝显示存在两个不同的婴儿进化枝：一个以长双歧杆菌猪亚种参考序列为主（蓝色），另一个以长双歧杆菌婴儿亚种参考序列为主（红色）。标注信息包括婴儿年龄（天数）、年龄类别、样本来源大陆及每个参考基因组的NCBI亚种分类。
（D）通过fastANI计算的参考序列间平均核苷酸同一性（ANI）显示三个不同进化枝，并指出猪亚种进化枝中一个基因组的错误注释。行标注显示NCBI亚种注释，进化树中基因组聚类的进化枝以颜色标注（灰色：类似成人的长亚种主导进化枝；蓝色：类似婴儿的猪亚种主导进化枝；红棕色：类似婴儿的婴儿亚种主导进化枝）。
（E）使用dbCAN3构建的长双歧杆菌参考序列碳水化合物活性酶（CAZyme）亚家族存在-缺失矩阵，显示进化枝间碳水化合物降解潜力的差异。行标注为每个基因组的亚种注释（包括错误标注基因组的重新注释），列标注指示每种碳水化合物活性酶的底物来源及亚种间是否存在显著差异（Fisher精确检验）。
先前的研究指出，人类肠道中存在三种主要的长双歧杆菌亚种：母乳喂养期间在婴儿体内旺盛生长的长双歧杆菌婴儿亚种、与长双歧杆菌猪亚种密切相关且在引入固体食物后的孟加拉国婴儿中高度富集的过渡亚种，以及1岁后占主导地位的长双歧杆菌长亚种。利用公开的长双歧杆菌分离株基因组（STAR方法），我们观察到成人主导的进化枝与长双歧杆菌长亚种的参考序列聚类，且落入成人进化枝的婴儿样本主要来自欧洲（成人富集进化枝中欧洲婴儿样本的优势比为14.2，Fisher精确检验p值 = 1.37×10-7）。我们还观察到两个主要由婴儿样本构成的进化枝（图3C）。主要的婴儿特异性进化枝以多个长双歧杆菌婴儿亚种参考序列为特征，包含欧洲和非洲婴儿（图3C，红色）。较小的婴儿特异性进化枝（图3C，蓝色）中长双歧杆菌猪亚种参考序列聚类，非洲样本在此显著富集（广义线性模型[GLM]显示欧洲样本在该进化枝的对数优势比 = -3.32，p = 8.13×10-8）。这一较小的婴儿特异性进化枝可能代表长双歧杆菌猪亚种和/或其近缘过渡型长双歧杆菌，如先前在孟加拉国观察到的，其可能在非西方化人群中更为普遍。尽管该进化枝中存在一条标注为长双歧杆菌长亚种的参考序列，但无论是基于全基因组平均核苷酸同一性（ANI）值（图3D）还是泛基因组基因存在-缺失矩阵，该基因组均与长双歧杆菌猪亚种参考序列更为接近（与标注为猪亚种的基因组平均ANI = 97.7，与婴儿亚种 = 95.1，与长亚种 = 95.3），提示GCA_000092325可能被错误标注为长双歧杆菌长亚种。
已知长双歧杆菌亚种含有独特的碳水化合物活性酶（CAZymes），使其能够适应婴儿饮食的转变。与此一致，我们在长双歧杆菌婴儿亚种进化枝的基因组中观察到针对乳汁（pFisher = 0.005）和黏蛋白（pFisher = 0.02）底物的碳水化合物活性酶富集（图3D）。综上所述，这些结果证实我们使用的统计框架也可用于识别与人类表型相关的亚种变异。
亚洲和欧洲老年个体中活泼瘤胃球菌进化枝的富集
在发现婴儿中富集的特定长双歧杆菌亚种后，我们探究了微生物进化枝是否也可能在其他年龄组中富集。我们鉴定出5个亚洲微生物系统发育树中存在在90岁以上个体中富集的进化枝，包括活泼瘤胃球菌（elpd_diff = -65.5）（图4A）、科普利赛加泰拉菌（elpd_diff = -14.2）、一种克雷伯菌（elpd_diff = -5.2）、Onderdonk拟杆菌（elpd_diff = -5.4）和普拉梭菌（elpd_diff = -4.2）。这些90岁以上个体主要来自XuQ_2021研究（47/48例），该研究聚焦于中国90岁以上老人和百岁老人。
图4 | 以高龄及独特胆汁酸丰度为特征的活泼瘤胃球菌进化枝
（A）在亚洲样本中构建的SGB4584活泼瘤胃球菌的系统发育树显示，一个具有高强系统发育信号的进化枝在高龄个体中富集（以灰色突出显示）。外环标注了系统发育效应中位数（phylo_effect_median，指示每个样本中年龄预测的系统发育信号强度，见STAR方法）、年龄类别和年龄。
（B）纳入欧洲样本后的系统发育树显示，高龄个体富集的进化枝末端节点数量增加。外环标注了系统发育效应中位数、年龄类别、年龄和大陆信息。
（C）使用欧洲成年人样本，比较（B）中突出显示的进化枝（高龄个体富集进化枝）与其他所有样本的年龄差异，结果显示属于该进化枝菌株的欧洲成年人平均年龄更高。
（D和E）与（B）中高龄个体富集进化枝以外的样本相比，KurilshikovA_2019和ZhernakovaA_2016的研究中该进化枝样本的（D）血浆胆酸和（E）鹅去氧胆酸相对丰度更高。
当仅使用XuQ_2021研究的样本时（在此场景中，队列间批次效应可能不产生影响），我们成功证实了活泼瘤胃球菌系统发育与年龄的关联（elpd_diff = -20.1，90岁以上个体占47/96例样本）。在此包含56-105岁个体的96份样本构建的系统发育树中，我们观察到一个主要进化枝显著富集90岁以上个体。该主要进化枝内高龄个体的富集具有统计学意义（XuQ_2021研究中的广义线性模型pxuQ = 3.14×10-5，所有亚洲研究中纳入研究效应的广义线性混合模型GLMER pAsian\_tree = 1.75×10-11），且独立于人体测量学、家庭背景或技术混杂因素（GLM pxuQ = 6.8×10-4）。有趣的是，尽管欧洲样本中无90岁以上个体（系统发育树的1171例样本中80岁以上个体占21例），我们仍观察到活泼瘤胃球菌与年龄之间存在显著的系统发育信号（elpd_diff = -34.99）。通过在系统发育树中纳入所有欧洲样本（图4B），并比较高龄个体富集进化枝（基于亚洲样本定义）内外的欧洲样本平均年龄，我们发现该进化枝内欧洲样本的平均年龄显著更高（纳入研究效应的GLMER模型，年龄对数优势比 = 0.03，p = 1.88×10-9）。即使将分析限制于年龄>18岁的样本，该年龄差异仍然存在（GLMER，对数优势比 = 0.04，p = 7.5×10-11）（图4C）。此外，在GacesaR_2022研究的少数个体中（n=48，平均年龄=61.1岁，其中5例属于高龄个体富集进化枝），城市化程度对该进化枝与年龄的关联无混杂效应（p = 0.03，控制城市化程度后p = 0.02）。总体而言，这表明该进化枝的活泼瘤胃球菌菌株更常见于高龄个体，且与地理起源无关。
活泼瘤胃球菌此前被报道与炎症相关，但一项中国研究也显示其与长寿相关。既往研究还强调该菌参与胆汁酸代谢，尤其是异胆汁酸的生成，而这类物质在日本百岁老人中含量升高。尽管我们的合并队列中缺乏90岁以上个体的胆汁酸数据，但荷兰ZhernakovaA_2016和KurilshikovA_2019队列提供了15种胆汁酸的血浆测量值（注：异胆汁酸未被检测，故未纳入分析）。尽管样本量有限（ZhernakovaA_2016队列69例样本，13例属于高龄个体富集进化枝；KurilshikovA_2019队列31例样本，10例属于该进化枝），我们仍在FDR校正后识别出活泼瘤胃球菌系统发育中两项独立于年龄和性别的统计学显著关联。具体而言，该进化枝与两种未结合初级胆汁酸的丰度相关：胆酸（线性混合模型，估计值 = 0.09，FDR = 1.39×10-4）（图4D）和鹅去氧胆酸（线性混合模型，估计值 = 0.1，FDR = 2.33×10-4）（图4E；表S5.1）。这些发现表明，高龄个体中富集的该活泼瘤胃球菌进化枝参与胆汁酸代谢，支持了既往研究结果。
为进一步探索胆汁酸代谢与高龄个体富集的活泼瘤胃球菌进化枝之间的关联，我们重建了高质量的活泼瘤胃球菌宏基因组组装基因组，并聚焦于13个已知胆汁酸相关基因（包括bai基因、胆汁盐水解酶和羟基类固醇脱氢酶）的预测存在情况。在高龄个体富集进化枝样本的308个MAG中，有36个显示7βHSDH基因耗竭（错误发现率FDR = 3×10-8，进化枝内流行率 = 0.28，其他区域 = 0.8），而3αHSDH（FDR = 0.02，进化枝内流行率 = 0.556，其他区域 = 0.324）、BaiA（FDR = 0.02，进化枝内流行率 = 0.55，其他区域 = 0.32）和BSH（FDR = 3×10-8，进化枝内流行率 = 0.44，其他区域 = 0.06）基因显著富集。由于其中部分基因通常存在于操纵子中，我们还鉴定了与代谢相关的生物合成基因簇，发现黄素酶糖分解代谢的生物合成基因簇耗竭（FDR = 1.99×10-6，进化枝内流行率 = 0.04，其他区域 = 0.75）。总体而言，这表明高龄个体富集的活泼瘤胃球菌进化枝与年轻个体相比，在胆汁酸代谢基因的编码及糖分解代谢路径上存在差异。
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