人类微生物组遗传与地理信息和物种水平传播能力相关性研究（一）
人类肠道中栖息着数千种微生物，每种微生物都表现出显著的个体间遗传变异性。尽管许多研究已将微生物相对丰度与人类健康相关表型联系起来，但肠道微生物的种内遗传变异尚未得到全面考量，这限制了将此类遗传特征与宿主状况关联的潜力。在此，我们分析了来自全球94项微生物组研究的32152个宏基因组，以探究人类微生物组的种内遗传多样性。我们重建了583个物种特异性系统发育树，并将其与地理信息和物种水平传播能力相关联。我们鉴定出484项微生物菌株水平与241种宿主表型的关联，涵盖人体测量指标、生化检测、疾病和生活方式。我们观察到，在90岁以上高龄老人中，活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）进化枝的流行率较高，这与其独特的血浆胆汁酸谱相关；同时发现了与黑色素瘤和前列腺癌相关的柯林斯菌（Collinsella）进化枝。我们的大规模种内遗传分析凸显了菌株多样性与人类健康的相关性。
结果
1660个全球微生物系统发育树的系统发育重建
我们评估了来自24829名个体的32152份肠道宏基因组样本。这些样本主要为欧洲样本（65%），主要归因于荷兰裔个体数据集的贡献（占总数的35%），其中15.8%来自北美，14.3%来自亚洲，3.83%来自非洲，0.5%来自大洋洲和南美洲（图1A；表S1.1）。我们使用StrainPhlAn 4，对1660个物种水平基因组箱（SGBs，以下用作与“物种”同义的操作定义）进行了系统发育重建，这些物种有足够样本且覆盖度充足（STAR方法；图1B；表S1.3）。
图1|人类肠道宏基因组鸟枪法测序构建1660种肠道微生物的全球系统发育树
（A）本研究中使用的肠道宏基因组样本的地理来源和样本量全局概览，共涵盖来自42个国家的32152份样本。
（B）宏基因组数据集中各物种水平基因组箱（SGB）的检出率及纳入其系统发育树的样本数量。300样本阈值（虚线）为纳入后续分析的筛选标准。
（C）基于本研究中各SGB代表性基因组构建的整体系统发育多样性（STAR方法）。红色标注的583个SGB被纳入下游分析。
StrainPhlAn 4仅考虑每个样本中的优势菌株，即使用每个个体样本中丰度最高菌株的单倍型。尽管基于优势菌株的分析可能会忽略样本内同一物种中多种共存菌株的存在，但我们认为这是当前的必要选择。这是因为：非优势菌株的分析会受到菌株特异性碱基识别误差的影响，且在当前宏基因组测序深度下，对数正态丰度分布和种内菌株优势现象导致非优势菌株的丰度极低。因此，非优势等位基因频率常与测序噪声难以区分，或仅能偶尔被可靠检测。在我们的数据中，每个物种经高度支持的多态性位点比例确实较低（多态性位点百分比中位数范围：副流感嗜血杆菌为1.79%，SGB53517梭菌属细菌为0.026%）。覆盖度更高的物种中，该中位数呈上升趋势（rPearson=0.3，p=2.5×10-14），证实样本内变异可能存在，但需更高测序深度才能揭示。
为确保分析具有足够的统计效力，我们聚焦于583个由至少300份样本重建的SGB系统发育树（均匀拟杆菌的样本量最大为20956份，每个SGB的样本量中位数为929份）（表S1.3）。在这583个SGB中，567个属于4个主要人体肠道微生物门：芽孢杆菌门Bacillota（原厚壁菌门Firmicutes；n=412，纳入35%）、拟杆菌门Bacteroidota（原Bacteroidetes，n=98，纳入48%）、假单胞菌门Pseudomonadota（原变形菌门Proteobacteria；n=29，纳入31.5%）和放线菌门Actinomycetota（原Actinobacteria，n=21，纳入21.6%）。另有23个SGB属于9个次要门类，包括两个古菌门archaeal phyla（泉古菌门Crenarchaeota和广古菌门Euryarchaeota）（图1C）。
我们通过多个步骤评估不同样本批次和研究对系统发育树的影响。我们证实，同一批样本使用不同DNA提取方法对SGB系统发育树的影响微乎其微。无论使用QIAmp Fast DNA Mini Kit还是QIAGEN AllPrep DNA/RNA试剂盒提取DNA，相同样本的菌株在系统发育树中的位置均较为接近（图S1A；表S2.1），且其遗传距离与测序噪声一致（图S1B-1D；表S2.2）。但正如预期，作为对比，FSK和APK在物种水平丰度谱上的相似性较低。此外，我们以酸奶来源的动物双歧杆菌菌株作为阳性对照——基于既往基于StrainPhlAn的研究，该物种在人体中的所有菌株因源自食物应完全一致。我们观察到，所有样本（无论研究背景和国家）中的目标菌株均一致，这与小鼠中天然的动物双歧杆菌菌株形成对比。这支持了既往发现：当该菌株存在于人体中时，样本处理和测序的技术偏差不会显著影响其遗传组成（图1D）。这些结果验证了我们评估微生物物种遗传多样性方法的准确性和稳健性。
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