青贮饲料中耐高温乳酸菌的生物学特性及发酵特性研究（三）
2.2分离的乳酸菌菌株生理生化特性及鉴定
测定了筛选到的4株乳酸菌和4株标准菌及1株商用植物乳杆菌LPC的生理生化特性(表2)。分离菌株均为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性，均呈杆状。LP149和LPC均无法消耗葡萄糖产生气体，可以产生DL-乳酸，表明它们是同型发酵乳酸菌，其余3株菌为异型发酵乳酸菌。
表2乳酸菌的生理生化特性
与标准菌株相比，LP149不能利用菊粉、山梨醇、D-甘露醇、水杨苷和半固体琼脂，对苦杏仁苷的利用较弱，能较好利用鼠李糖、木糖以及马尿酸(表3)；而LS358对菊粉、阿拉伯糖、马尿酸的利用能力较强，对水杨苷的利用较弱，不能利用山梨醇、D-甘露醇、鼠李糖、七叶苷和半固体琼脂；LR753对蜜二糖和木糖的利用能力良好，但相对于标准菌株，对菊粉的利用能力下降，对鼠李糖的利用能力有所提；LPA761不能利用菊粉和苦杏仁苷，对鼠李糖利用能力较强，对棉子糖和乳糖的利用能力减弱。系统发育树结果表明，LP149、LS358、LR753及LPA761与L.plantarum、L.salivarius、L.rhamnosus和L.paracasei标准菌序列相似度均为100%(图2)。
表3乳酸菌糖发酵特性
图2筛选出的乳酸菌系统发育树
分支节点上的数字代表在1 000次构树过程中的自展值，标尺代表的序列差异度为1%。
2.3乳酸菌耐温、耐酸及耐盐特性测定
与标准菌株相比，LS358、LR753和LPA761在45°C培养条件下生长良好（表4），表明其耐高温性较好。与37°C相比，45°C培养下的乳酸菌表现出不同的耐性特征（表5、表6）。在45°C条件下，筛选出的4株乳酸菌均能在pH 4.5～7的液体培养基良好生长。在NaCl浓度为3%的液体培养基中，LPA761生长较弱，LP149、LS358和LR753生长状况良好，在pH7.5的液体培养基中LP149和LR753生长能力较差，LS358和LPA761生长能力强。4株乳酸菌均不能在NaCl浓度为6.5%和pH 3～4的液体培养基中生长。
表4乳酸菌耐温性特征
2.4乳酸菌菌株生长曲线测定
与标准菌株相比较，4株乳酸菌菌株的生长曲线在37和45℃有着不同的表现(图3)。在37℃时，除LP149外，3株自选乳酸菌从培养10 h开始生长速度达到最大，大概20 h后生长进入稳定期，菌株LP149未表现出明显的对数期和稳定期，在14 h时生长速率最快，在22 h到28 h时OD值急剧下降。菌株LP149、LS358、LR753和LPA761发酵20 h的OD值分别为1.798、0.904、1.438和1.373。综上，24 h内LR753的生长速度最快且较稳定，LPA761生长速度较快，LS358的生长速度最慢。
图3乳酸菌生长曲线
在45℃时，与标准菌株相比(图3)，4株自选菌株的生长情况均更加良好。LP149在12 h时OD值达到最大，从16 h开始进入稳定时期；LS358在8 h时生长速率最大，从10 h开始OD值较稳定上升；LR753在12 h时生长最快，从16 h开始进入较稳定的时期；LPA761在8 h时生长速率达到最大，从10 h开始进入稳定期。
2.5乳酸菌菌株产酸能力对比
在37和45℃下，所有菌株的pH均从5.5开始总体呈下降的趋势，在4.3左右达到稳定(图4)。37℃时，LP149的pH波动较大；LS358和LR753在14 h时产酸速率最大，在20 h左右进入稳定期；LPA761在10 h时pH下降最快，在20 h时进入稳定时期。
图4乳酸菌产酸曲线
45℃时(图4)，LP149、LS358、LR753和LPA761在8 h左右产酸速率达到最大，10 h左右进入稳定时期。而标准菌株和商业菌株则花费了更多的时间才使得pH下降，且在48 h时pH高于自选菌株。
3.讨论
根据先前使用高通量测序技术对与本研究同一样品的微生物群落结构的研究发现，高温高湿地区青贮原料附生细菌群落主要是魏斯氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酸杆菌属和明串珠菌属(Leuconostoc)。然而，用这种方法无法获得乳酸菌种水平上的重要信息。传统的形态学、生理生化特征鉴定和单株菌16S rRNA基因序列分析是弥补高通量测序精度不足的有效手段。本研究发现，植物乳杆菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌为青贮原料上附着乳酸菌优势种。同型发酵的片球菌属细菌是青贮中启动菌，在发酵初期便能快速产酸，为乳酸杆菌的生长创造一个适宜的厌氧环境。此外，Li和Nishino报道了在玉米青贮饲料中使用梯度凝胶电泳(DGGE)检测到W.paramesenteroides存在。之前的研究表明，青贮后乳酸杆菌是主要的微生物属，相对丰度超过50%，其次是醋酸菌和魏氏菌。但具体是哪些种类的乳酸杆菌还不得而知。本研究通过对227株分离到的乳酸菌进行鉴定发现，鼠李糖乳杆菌是四川宣汉地区玉米青贮的优势种，副干酪乳杆菌和植物乳杆菌是四川崇州地区、重庆云阳地区和贵州黔西南地区全株玉米青贮中最丰富的种。通常，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌是世界范围内不同地区不同青贮类型中常见乳酸菌。尽管鼠李糖乳杆菌被报道作为青贮饲料接种剂，但在自然发酵青贮饲料中并未广泛发现。
乳酸菌的特性和储存温度对发酵质量有很大影响。在发酵的初始阶段，当青贮窖中仍存在空气时，青贮饲料的温度可能会超过40℃，这是由于持续的植物呼吸和有氧微生物的活动，尤其是在热带和亚热带地区。由于在高温条件下，普通菌株不能很好地生长，因此建议使用耐热乳酸菌加强高温地区的青贮饲料发酵。在本研究中，筛选出的菌株LP149、LS358、LR753和LPA761在45℃和最低初始pH 3.5下都能生长。然而，LPC仅在初始pH为3.5时轻微生长，在45℃时不能生长。因此，从高温高湿地区采集的青贮中筛选的菌株LP149、LS358、LR753和LPA761有更好的高温适应性。
产酸速率和生长速率是评定乳酸菌活性与是否优良的重要指标，不同菌株间具有一定程度的差异。微生物的生长曲线一般分为4个阶段：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。在本研究中，高温对乳酸菌生长曲线和产酸曲线有较大影响。与在37℃培养下的菌株相比，在45℃培养下的LP149、LS358、LR753和LPA761都无明显的迟缓期，比标准菌株和商业菌株更早地进入对数期和稳定期，展示出了优良的耐高温性和产酸效率，值得进一步在高温青贮中进行验证。
4.结论
天然植物乳杆菌是高温高湿地区玉米和杂交象草原料和青贮料中最常见的乳酸菌菌株，其次是鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌。根据生理、生化特征和16S rRNA测序分析，筛选出的4株乳酸菌LP149、LS358、LR753和LPA761分别被鉴定为植物乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌。筛选出的4株乳酸菌有良好的高温适应性，不仅生长速度快，产酸能力强，耐盐性较好，对糖源利用范围广，而且对酸性环境有较好的适应性，特别是唾液乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，作为较少被报道的异型发酵乳酸菌，可以作为后续进行高温青贮回填试验的新型菌株。
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