HU0460抑制马铃薯黑胫病菌的MIC、MBC与生长曲线测定
摘要
马铃薯黑胫病是由软腐果胶菌属马铃薯黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica, Pat)引起的细菌性土传病害，该病严重影响马铃薯(Solanum tuberosum)产业的发展。本研究采用马铃薯琼脂培养基(PDA)从银叶树(Heritiera littoralis)的茎、叶组织分离出内生真菌，通过玉米培养基和大米培养基固体发酵得到真菌代谢产物，以滤纸片法筛选抗黑胫病菌的高活性代谢产物，采用ITS序列比对和形态观察进行菌种鉴定。代谢产物经乙醇浸提浓缩和正相硅胶柱层析获得活性组分，通过抑菌曲线和生长曲线测定、扫描电镜观察菌体形态及DiBAC4(3)荧光探针检测膜电位等手段探究了代谢产物对Pat的作用及机制，采用薯块接菌法分析活性代谢产物对Pat的防控效果。
结果发现，内生真菌HU0460的玉米发酵物对Pat有较好的抑菌活性;HU0460经形态学和ITS序列鉴定为黑孢属真菌(Nigrosporasp.)。玉米发酵物经乙醇浸提和正相硅胶柱层析初步分离获得对Pat有明显抑菌效果的活性组分，其对Pat的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)分别为2.4410和3.9110-2μg/mL。扫描电镜观察发现，随着活性代谢产物浓度的上升，Pat的形态变化程度加剧，其浓度达到MBC时，菌体出现破裂、细胞内容物流失等现象。DiBAC4(3)荧光探针检测结果显示，HU0460活性代谢产物处理导致Pat的荧光强度上调，使Pat的膜电位发生去极化。进一步用薯块接菌实验证实，活性代谢产物可明显抑制Pat对薯块的侵染性。本研究分离筛选获得了抗马铃薯黑胫病菌的生防内生真菌一黑孢菌HU0460,分离的活性代谢产物对Pat有较好的抗菌作用,为马铃薯黑胫病的生物防控及后续农用抗生素研发提供菌种和参考数据。
马铃薯(Solanum tuberosum)是全球第四大农作物，亦是我国的四大主粮之一，对我国粮食安全生 tobacteriu产具有战略意义(高玉林等，2019)。根据气温、降水及土壤类型等自然条件的不同，我国马铃薯种植区域划分为北方一作区、西南混作区、中原间作区和南方冬作区4个区域，其中惠东县是广东省最大的冬种马铃薯出口生产基地，每年种植面积保持约0.87万hm2，占耕地面积的一半以上，通过“稻-稻-薯”轮作模式，充分利用冬闲田提高地方经济收入(徐进等，2019)。但近10年来南方冬作区黑胫病发病率逐年上升，该病作为细菌性土传病害在马铃薯各生育期均可发病，并因发病急、死苗率高、难防难治，使马铃薯的品质、产量和商品薯率大幅下降，成为制约马铃薯产业发展的瓶颈(Mao et al.,2019)。广东乃至全国目前对马铃薯黑胫病尚缺乏有效防控技术。
冬种马铃薯黑胫病主要由软腐果胶菌属(Pec-)马铃薯黑腐果胶杆菌(P.atroseptica,Pat)引起，该病以马铃薯植株茎基部变黑的症状而得名。目前黑胫病防治以化学防控为主，但是长期使用化学农药易造成环境污染和食品安全等问题(冯志文等，2020)。生物防治因其高效、安全、不产生抗药性等优势，符合农业绿色安全种植和农业可持续发展的需求。筛选生防菌是生物防控细菌性土传病害的研究热点，早期的生防菌株多数分离自寄主植物根际及植株体内(方园等，2022)。植物内生菌存在于健康植株的各个组织和器官中，不仅不会引起宿主植物出现病害，其分泌的一些次生代谢产物还能抑制植物病原菌(李腊等，2022)。李露丹等(2021)综述了珍稀药用石斛(Dendrobium)内生菌及其与宿主的关系;翟大才等(2019)从野生黄精(Po-lygonatum cyrtonema)根状茎分离到内生枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)HJ-2,发现抑菌物质主要存在于发酵液中，且对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均具有显著抑菌效果。综上，药用植物内生菌是筛选结构新颖次级代谢产物的重要资源，开发利用植物内生菌及其活性代谢产物资源具有重要意义。
目前对马铃薯黑胫病的生物防控研究少见报道，筛选并构建生防菌种库和代谢产物库有利于安全有效地防控马铃薯黑胫病，保障马铃薯的绿色生产(孟焕文等，2020)。银叶树(Heritiera littoralis)的枝叶提取物具有杀菌、杀螨等药用价值(林国盛，菌落形态。2019),有关银叶树内生真菌的研究尚未见报道，鉴于银叶树具有抗菌功效，本研究拟从健康银叶树的组DN幼嫩枝条中分离筛选对马铃薯黑胫病菌具有显著拮抗作用的内生真菌，并对生防真菌代谢产物的抑菌作用进行分析，以期为马铃薯黑胫病的生物防治提供菌种资源和代谢产物资源。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试植物和菌种
健康的银叶树(Heritiera littoralis)幼嫩枝条于2019年5月采自广东省海丰县小漠镇香坑(22°48'15.38" N,115°01'33.62"E,海拔2m)。马铃薯黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atroseptica, Pat)分离自广东省惠东县冬种马铃薯基地，由惠州学院微生物实验室分离鉴定和保存。
1.1.2培养基
马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA):马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,琼脂粉20g,水1000mL;营养琼脂培养基(NA):蛋白胨10g,牛肉粉3g,氯化钠5g,琼脂15g,pH7.3±0.1;LB肉汤培养基:蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠5g,葡萄糖1g,pH7.0±0.2。玉米固体发酵培养基(CR)或大米固体发酵培养基(RI):玉米或大米60g，蒸馏水60mL。所有培养基均经121℃高压灭菌20min备用。
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